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简单讲述荧光定量 PCR 原理

发布时间:2020-02-12 17:58 |  点击次数:

标签:荧光定量 PCR PCR 试剂  实时荧光定量 PCR 耗材 

所谓实时荧光定量 PCR 技术 ,是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。以下便是天津本生生物就荧光定量 PCR 原理的简要说明,一起来看下:

检测方法:

1.SYBRGreenⅠ法:在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 定量 PCR 扩增荧光曲线图 PCR 产物熔解曲线图 (单一峰图表明 PCR 扩增产物的单一性)

2.TaqMan 探针法:探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5』-3』外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步。

1. 荧光阈值 (threshold) 的设定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省 (默认) 设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍,即:threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct 值与起始模板的关系每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,公式如下。Ct =-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n 为扩增反应的循环次数,X0 为初始模板量,Ex 为扩增效率,N 为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。起始拷贝数越多,Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代 Ct 值。因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量 PCR 所使用的荧光物质可分为两种:

1. TaqMan 荧光探针:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变 (SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的当选技术平台。

2. SYBR 荧光染料:在 PCR 反应体系中,加入过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料非特异性地掺入 DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。SYBR 仅与双链 DNA 进行结合,因此可以通过溶解曲线,确定 PCR 反应是否特异。

3. 分子信标:是一种在 5 和 3 末端自身形成一个 8 个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近,不会产生荧光。PCR 产物生成后,退火过程中,分子信标中间部分与特定 DNA 序列配对,荧光基因与淬灭基因分离产生荧光 。

1. 传统定量 PCR 方法简介:

1) 内参照法:在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记,下游引物不标记。在模板扩增的同时,内标也被扩增。在 PCR 产物中,由于内标与靶模板的长度不同,二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来,分别测定其荧光强度,以内标为对照定量待检测模板。

2) 竞争法:选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中,待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增 (其中一个引物为荧光标记)。扩增后用内切酶消化 PCR 产物,竞争性模板的产物被酶解为两个片段,而待测模板不被酶切,可通过电泳或高效液相将两种产物分开,分别测定荧光强度,根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3)PCR-ELISA 法:利用 digaoxin 或生物素等标记引物,扩增产物被固相板上特异的探针所结合,再加入抗 digaoxin 或生物素酶标抗体-辣根过氧化物酶结合物,最终酶使底物显色。常规的 PCR-ELISA 法只是定性实验,若加入内标,作出标准曲线,也可实现定量检测目的。

2. 内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测,即 PCR 到达平台期后进行检测,而 PCR 经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验,所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3. 内标对定量 PCR 的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标,则 PCR 反应变为双重 PCR,双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争,尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时,这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的,所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因,传统定量方法虽然加入内标,但仍然只是一种半定量的方法。 实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品 Ct 值的计算,根据标准曲线获得定量结果。

因此,实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的:

1)Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期 (对数期),此时微小误差尚未放大,因此 Ct 值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的 Ct 值是恒定的。

2)Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。 各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。由于 qPCR 是实时定量检测致病病原体基因核酸,因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优 

产品优势:
本生生物代理实验室耗材,PCR 耗材品种全,可替代仪器原厂耗材,性价比高,质量稳定,对用户可以节省实验成本。

适应客户:
医院检验科 PCR 实验室,中心实验室,肝病中心;第三方检测机构,科研院所,大专院校,制药厂,试剂生产厂家,疾控中心,检验检疫。

注:本信息最终归属权:本生 (天津) 健康科技有限公司,以上信息仅供参考!