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DNA提取方法的总结

发布时间:2019-10-25 15:44 |  点击次数:

DNA提取方法的总结:

细菌DNA的提取:
(一)
试剂:
1. 抽提缓冲液
2% CTAB (W/V)
2% PVP K25 (w/v) (去色素)
100mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM EDTA (pH8.0)
2.0M NaCl
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water(抑制RNA酶活性)
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步骤:
1.抽提缓冲液65℃预热;
2. 加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10min;
3. 加酚/LV仿/ywc(25:24:1),振荡,离心12,000rpm,10min;
4.取上清,加LV/ywc(24:1)振荡,离心12,000rpm,10min; 
5. 取上清,重复4步骤;
6. 加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇(或加入等体积的ybc),-20C沉淀;
11. 离心12,000rpm,10min;
12. 弃上清,70%乙醇洗,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml 水中。
(二)(我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法)
1. 将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入80ul CTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/LV/ywc混匀,离心4-5min, 将上清转入一只新管中,加入0.6-0.8倍体积的ybc,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇.
真菌DNA的提取:
(一)
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液,快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的LV:ywc(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)
4.1000rpm,4℃,5min
5.上清用体积的LV:ywc(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
6.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
9.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min) 
10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用
DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,
3M NaAc 
(二)
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min
4.等体积的LV仿:ywc(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷ybc, 混匀, 静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中
7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
8.用酚(pH8.0):LV仿:ywc(25:24:1)和LV仿:ywc(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min) 
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。

 
注:仅供参考!