详述实验室免疫血清的制备实验!

详述实验室免疫血清的制备实验！
标签： 免疫 血清 制备 实验

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂 (如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得价的免疫血清。本生生物整理如下：

实验材料：家兔

试剂、试剂盒：灭菌生理盐水 IgG 酒精 碘酒 羊毛脂 石蜡油 BCG FIA FCA-IgG

仪器、耗材：剪刀 镊子 注射器 针头 称量瓶 量筒 动物固定架 三角烧瓶 手术器械 血管夹 黑丝线 放血管

实验步骤：

1. 心脏采用血法

(1) 家兔仰面，四肢缚于动物固定架上 (或由助手抓住四肢固定)。

(2) 剪去左胸部兔毛，消毒皮肤。

(3) 用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位。

(4) 用 50 ml 注射器 (连接 16 号针头)，倾针 45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死。

(5) 将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

2. 颈动脉放血法

(1) 家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤。

(2) 沿颈部中线切开皮肤约 10 cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌。

(3) 分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离。

(4) 于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住。

(5) 用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。

(6) 松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血 80～100 ml。

三、分离血清

将三角烧瓶的血置 37 ℃ 温箱 1 小时，再置 4 ℃ 冰箱内 3～4 小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于 3000 rpm 离心 15 分钟，取上清加入防腐剂 (0.01 % 硫柳汞或 0.02 % 叠氮钠，最终浓度)，分装后置 4 ℃ 冰箱中保存备用。

注意事项：

1. 免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。

2. 免疫用的抗原必须经 FCA 或 FIA 充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用 H-81 微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡 (频率 2900 转/分，振幅 6 mm); 后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约 1 小时即可使抗原充分乳化。

3. 佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物 (0.005 mgN) 产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对 BCG 过敏，尤其是豚鼠其次是家兔，当再次注射完全佐剂时，可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中 BCG 的含量或改用不完全佐剂，以减少和防止变态反应的发生。

4. 抗原的剂量决定于抗原的种类。对免疫原性强的抗原剂量应相别较少，免疫原性弱的抗原剂量可相对较多。抗原的用量一般以体重计算。在使用佐剂的情况下，一次注入的总剂量以 0.5 mg/kg 体重为宜。如不加佐剂时剂量可加大 10 倍。另外，免疫周期长者可少量多次注射，免疫周期短者可较大量少次注射。

5. 免疫方法上也可采用多点注射法免疫动物。即于家兔脊柱两旁选 4-6 点皮下注射，同时于两侧肩部 (或臂部) 和鼠蹊部各注一处。每点注 0.2 ml，间隔 2 周后再于上述部位选不同点同上注射，也可产生高效价的免疫血清。

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注：以上信息仅供参考!