过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒(微量法)

　　过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒(微量法)
 

　　测定原理：H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。

　　测定意义：H2O2是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H2O2不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体;另一方面H2O2也是许多氧化应急反应中的关键调节因子

　　注意：正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

　　规格：100T/96S

　　需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、丙酮、浓盐 酸、研钵和冰。

　　产品内容：

　　试剂一：丙酮 100mL×1 瓶，4℃保存;(自备)

　　试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存;临用前加入 3mL 浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂 4℃保存;

　　试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃保存; 试剂四：液体 30mL×1 瓶，4℃保存;

　　标准品：液体 1mL×1 支，4℃保存，1mmol/mL H2O2标准液。

　　过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒操作步骤：

　　一、H2O2提取：

　　1、细菌或细胞样品的制备： 收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一，超声 波破碎细菌或细胞(功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次);8000g 4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。

　　2. 组织样品的制备： 称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待 测。

　　3、血清(浆)样品：按照每 100μL 血清(浆)加入 0.9mL 试剂一的比例充分混匀;8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

　　注意事项： 1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。 2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。

　　二、测定步骤:

　　1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 415nm，蒸馏水调零。

　　2、将试剂二、三和四 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。

　　3、如果用 96 孔板将则用丙酮将 1mmol/mL 标准液稀释为 2μmol /mL 的标准溶液，用微量玻璃比色 则用丙酮将 1mmol/mL 标准液稀释为 1μmol /mL 的标准溶液。

　　4、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

　　

 

　　加入试剂四溶解沉淀后(可先用丙酮清洗 3-5 次来洗去植物色素)，室温静置 5min，取 200μL 转移至微量玻璃比色皿或 96 孔板中测定 415nm 处吸光值。对照管只要做一次即可。计算∆A 测定=A 测定管-A 对照管，∆A 标准=A 标准管-A 对照管。

　　三、H2O2含量计算：

　　1、按照细菌、细胞数量计算： H2O2含量(μmol/10 4cell)=∆A 测定÷(∆A 标准÷C 标液)×V 样本÷(500×V 样本÷V 提取) =0.004×∆A 测定÷∆A 标准。

　　2、按组织鲜重计算： H2O2含量(μmol/g 鲜重)=∆A 测定÷(∆A 标准÷C 标液)×V 样本÷(V 样本÷V 提取×W) =2×∆A 测定÷∆A 标准÷W。

　　3、按照蛋白浓度计算： H2O2含量(μmol/mg prot)=∆A 测定÷(∆A 标准÷C 标液)×V 样本÷(Cpr×V 样本) =2×∆A 测定÷∆A 标准÷Cpr。

　　4、按血清(浆)体积计算： H2O2含量(μmol/mL)= ∆A 测定÷(∆A 标准÷C 标液)×10 =20×∆A 测定÷∆A 标准。

　　500：细胞或细菌总数，万个;C 标液：H2O2标准溶液浓度，2μmol/mL;

　　V 样本：加入的样本 体积，0.25mL;W：组织鲜重，g;V 提取：提取过程中所用体积，1mL;

　　Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL; 10：血清稀释倍数，[0.1mL 血清(浆)+0.9mL 试剂一] ÷0.1mL 血清(浆)=10。

　　注意：如果用微量玻璃比色皿(光径 d=1cm)将 1mmol/mL 标准液稀释为 1μmol /mL 的标准溶液。 计算公式亦作改变。

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