技术干货| 多克隆抗体的制备

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　　技术干货| 多克隆抗体的制备

　　(1)动物的选择。选择合适的动物是制备抗血清的首要条件。选择时应注意以下几个问题。

　　①抗原与免疫动物的种属差异越远越好，亲缘太近不易产生抗体应答。

　　②抗血清的需求量。从大型动物如马、骡等可获得大量的血清。

　　③抗血清的要求。抗血清可分为R型和H型，其中常用R型。

　　④根据抗原的情况选择。蛋白质抗原适合于大部分动物如山羊和家兔，但某些动物体内含有类似的物质如IgE，多种酶对这些动物的免疫原性极差，免疫后不易出现抗体。

　　⑤甾体激素免疫多用家兔，酶类免疫多用豚鼠。

　　(2)免疫剂量、时间和途径 抗原的剂量选择应考虑抗原性强弱、分子量大小、动物大小、免疫时间等因素。抗原需要量多，时间间隔大，剂量可适当加大。大动物抗原剂量约为0.5~1. 0mg/只，小动物约为0. 1~0. 6mg/只。注射动物时一般采用多点注射，一只动物注射总点数约为8~10点，如足掌、耳后、背部两侧、领下等处皮内或皮下，还可采用肌肉、静脉、腹腔等途径。免疫间隔的时间也很重要。首次免疫后动物机体处于识别抗体和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般首次和第二次间隔10~20d为好，二次以后每次间隔一般为7~10d，不能太长，以免刺激变弱，抗体效价不高。

　　(3)动物采血将动物免疫 3~5次后，若其产生的抗血清鉴定合格，应在免疫后5~7d及时采血，否则抗体浓度会下降。常用的采血方法有:①颈动脉放血法，在动物颈外侧做皮肤切口，找到颈总动脉后剪断血管，放出功脉血; ②心脏采血法，此法多用于豚鼠、鸡等小型动物，采血时应注意穿刺位置; ③静脉多次采血法，家兔可用耳中央静脉，山羊用颈静脉，这种放血法可以隔日一次，多次采血，共可获得1500~ 2000mL血液。

　　抗血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置在37℃或40℃凝块。前者迅速，但血清较少;后者时间长，但血清量多。

　　(4)抗体的鉴定 抗血清在保存和使用前，必须做效价和特异性鉴定。

　　①双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性 按双向免疫扩散技术打两排孔，上排放抗原粗提物和纯化抗原，下排放抗血清，进行双扩散18~24h后，仔细观察上下两排孔之间出现的沉淀线。若与粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者相互融合，则证明该动物已产生单价特异抗体; 不出现沉淀线，表明未免疫成功。若与纯化抗原出现一条沉淀线，而与粗抗原出现多条沉淀线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接，也是成功的免疫，只需将其中的杂抗体除去，即可成为单价特异性抗体。

　　②双向免疫扩散法测定血清效价 测定抗血清效价有两种稀释方法:一是稀释抗血清，如1:2、1:4、1:8、1:16对倍稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应;另一是稀释抗原，即把抗原做对倍稀释，分别与不同浓度的抗血清进行双扩散实验。效价在1:8以上即可采血用于一般实验。

　　(5)抗体的储存 抗体具有严密的三维结构，使之能够抵御轻度变性的环境，长期存放较为容易。通常将甘油或其他稳定剂加入储存的抗体中。为了防止细菌或真菌污染抗体，可根据需要在抗体中加入抗微生物制剂，如0.02%的dd化钠或0.01%的硫柳汞。储存温度可以有三种选择:一是4℃保存，将抗血清除菌后液体状态放入普通冰箱，可存放三个月到半年以上;二是低温保存，即存放于-20到-40℃的低温冰箱，一般可保存5年以上效价不会有明显下降;三是冻干粉状态保存，最后抗体的水分不应高于0.2%，封装后可长期保存5-10年效价不会明显下降。

　　在保存时应注意抗体溶液不应反复冻融，因为反复冻融会导致部分抗体失活并产生不需要的蛋白-蛋白凝聚物，从而使活性降低甚至丧失。

　　(6)抗体的纯化 粗制的抗体可用于一般免疫化学试验，但较多情况下应使用纯化后的单价特异性抗体。单价特异性抗体是指抗血清只与其特异性抗原发生反应的抗体。由于抗原的纯度问题，在制备的抗血清中通常会含有其他杂抗体，因此必须除去杂抗体。纯化抗体的方法较多，如亲和色谱法、吸附剂法、离子交换色谱法等。建议采用蛋白A或蛋白G微球纯化法，这种方法效率高。A蛋白或G蛋白基质有商品化的产品，能将任何来源的抗体纯化，而且比常规方法简单，纯化效果是其他常规方法的数倍。

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