丁酰胆碱酯酶(BchE)活性检测试剂盒技术资料

　　丁酰胆碱酯酶(BchE)活性检测试剂盒技术资料

　　检测方法:可见分光光度法

　　英文名称:Butyrylcholinesterase Activity Assay

　　储存条件:-20℃

　　有效期:6个月

　　规格：50T/48S

　　产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

　　试剂名称 规格 保存条件

　　试剂一 液体 100 mL×1 瓶 2-8℃保存

　　试剂二 粉剂×1 瓶 -20℃保存

　　试剂三 液体 30mL×1 瓶 2-8℃保存

　　溶液的配制：

　　1. 试剂二：临用前加入 30mL 试剂一，充分溶解，-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融。

　　产品说明：

　　丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8)，又称血浆胆碱酯酶，假性胆碱酯酶，是一种丝氨酸水解酶，由肝脏合成后进入血液，几乎存在于所有动物组织中。BchE结构与乙酰胆碱酯酶(AchE)相似，但底物特异性和抑制剂敏感性不同。与AchE相比，BchE能够有效水解较大的胆碱酯，如丁酰胆碱和苯甲酰胆碱，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明，BchE可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点。

　　TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412nm吸光度增加速率，计算BchE活性。

　　Butyrylcholine Choline TNB (412nm)

　　注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

　　需自备的仪器和用品：

　　可见分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

　　丁酰胆碱酯酶(BchE)活性检测试剂盒 操作步骤：

　　一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

　　1. 组织样本：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)=1：5~10 比例加入试剂一(建议称取 0.1g 样本，加入 1.0mL试剂一)，冰浴匀浆后，于 4℃，12000rpm 离心 10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

　　2. 血清/血浆等液体样本：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。

　　3. 细菌、细胞：按照细胞数量 104 个：试剂一体积(mL)500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL 试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3 min)，于 4℃，12000rpm 离心 10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

　　二、测定步骤

　　1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

　　2. 操作表：(在1mL玻璃比色皿中加入下列试剂)

　　试剂名称(μL) 测定管 空白管

　　样本 50 -

　　蒸馏水 - 50

　　试剂二 500 500

　　试剂三 500 500

　　立即充分混匀后于412nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或恒温培养箱5min，拿出迅速擦干测定5min10s时的吸光值A2。计算ΔA测定=A测定2-A测定1，ΔA空白=A空白2-A空白1，ΔA=ΔA测定-ΔA空白。空白管只需测定1-2次。

　　三、BchE 活性计算

　　1. 按照蛋白浓度计算

　　活性单位定义：每 mg 蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。

　　BchE 活性(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109] ÷(Cpr×V 样)÷T×F=308.8×ΔA÷Cpr×F。

　　2. 按照样本质量计算

　　活性单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。

　　BchE 活性(U/g 质量)=[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T×F=308.8×ΔA÷W×F。

　　3. 按照血清/血浆等液体体积计算活性单位定义：每 mL 血清/血浆每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。

　　BchE 活性(U/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷V 样÷T×F=308.8×ΔA×F。

　　4. 按细菌/细胞数量计算

　　活性单位定义：每万个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 为 1 个酶活单位。

　　BchE 活性(U/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷(N×V 样÷V 样总)÷T×F=308.8×ΔA÷N×F。

　　ε：TNB摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm;d：比色皿光径，1cm;V反总：反应体系总体积，1.05mL=1.05×10-3L;

　　109：单位换算系数，1mol=1×109nmol;V样：反应体系加入样本体积，0.05mL;V样总：加入试剂一体积，1mL;

　　Cpr：蛋白浓度，mg/mL;W：样本质量，g;T：反应时间，5min;F：样本稀释倍数;N：细菌/细胞数量，以万

　　计。

　　注意事项：

　　1. 为保证结果准确，请严格控制反应时间，建议两人进行实验，一人加样，一人计时。

　　2. 如果∆A 测定接近∆A 空白，可以增加样本量后再进行测定;如果 A2 测定大于 1 或 ΔA 测定大于 0.7，建议将样本上清用试剂一适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

　　实验实例：

　　1. 取0.1018g大鼠肝脏样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，离心后上清液用试剂一稀释4倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定2-A测定1=0.6807-0.3913=0.2894，ΔA空白=A空白2-A空白

　　1=0.3552- 0.2931= 0.0621，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.2273，按样本质量计算得：BchE活性(U/g 质量)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T×F =2757.966 U/g 质量。

　　2. 取马血清样本，用试剂一稀释64倍，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定2-A测

　　定1=0.5100- 0.3436=0.1664，ΔA空白=A空白2-A空白1=0.3552- 0.2931= 0.0621，ΔA=ΔA测定-ΔA空白=0.1043，

　　按液体体积计算得：

　　BchE 活性(U/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V 反总×109]÷V 样÷T×F =2061.302 U/mL。　　丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8)，又称血浆胆碱酯酶，假性胆碱酯酶，是一种丝氨酸水解酶，由肝脏合成后进入血液，几乎存在于所有动物组织中。BchE结构与乙酰胆碱酯酶(AchE)相似，但底物特异性和抑制剂敏感性不同。与AchE相比，BchE能够有效水解较大的胆碱酯，如丁酰胆碱和苯甲酰胆碱，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明，BchE可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点。