关于PCR，原理、引物您知道多少

　　关于PCR，原理、引物您知道多少

　　PCR的原理

　　多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是近30多年发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术，可在数小时之内对仅有几个拷贝的基因放大千万倍。那么，PCR的原理是怎样的呢?

　　PCR技术实际上是在模板DNA、引物以及原料(四种脱氧核糖核苷酸)在适宜的反应条件下，通过DNA聚合酶的酶促反应完成DNA扩增的过程。

　　PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。PCR反应分为三步：

　　1)变性：通过加热时DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链DNA;

　　2)退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物复杂的多，而且反应体系中引物DNA量远大于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少;

　　3)延伸：在DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸第五以及Mg2+存在的条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应。

　　4)3步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板，30个循环左右，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量的复制，数量可达2×107个拷贝。

　　经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的作用，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。每循环一次，目的基因的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的基因以2n的形式增长。PCR扩增的特异性是由人工合成的一对引物来决定的。在反应的最初阶段，原来的DNA起着起始模板的作用，随着循环次数的增加，由引物介导的片段急剧增多而成为主要的模板。

　　PCR反应引物设计

　　PCR反应中引物起着很重要的作用。模板的不同、欲扩增的片段不同、需要的片段长度不同或者是用途不同等等，对引物的要求是不一样的。PCR作为一种体外酶促反应，其效率和特异性主要取决于两个方面，一是引物和模板结合的特异性，二是多聚酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。引物设计的原则一般遵循下列几项：

　　1、引物的长度以15～30bp为宜。引物过短会使特异性降低，过长则成本增加，而且也会降低特异性。常用的是18-27 bp，但不应大于38，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

　　2、引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C的含量在45～55%之间比较适宜，另外上下游引物的GC含量不宜差别过大。

　　3、引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在。二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。。

　　4、引物的碱基顺序不应与非扩增区有较高的同源性，减少非特异性扩增的产生。

　　5、引物3’末端碱基注意事项：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。另外引物3’末端的末位碱基在很大程度上影响着酶的延伸效率。有资料表明，引物3’末端碱基在错误配对时不同碱基的引发率存在很大的差异。当末位碱基是A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，而在末尾碱基是T时，错配时引发效率大大降低。引物3’末端最好不要选A.

　　6、引物5’末端碱基选择注意事项：引物5’末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，5’端碱基可以不与模板DNA配对而成游离状态。引物设计时可以在5’末端加上限制性内切酶位点或其他短的序列，可加启动子ATG，可加错配碱基引起突变。文献中报道，在引物5’末端加入10个游离的碱基并不影响PCR反应的进行。

　　注：以上资料仅供参考!

　　POD辣根过氧化物酶 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。