干货分享：Elisa试剂盒常用方法及常见问题详解

　　Elisa试剂盒常用方法及常见问题详解

　　ELISA原理及类型ELISA是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。酶联免疫吸附试验的标准程序，通常是把蛋白、抗体、或激素等(即抗原)直接或是以捕捉抗体(capture Ab)固定在固相载体上，再加入一级检测抗体(primarydetection Ab)，形成一个抗原抗体的复合物。如果该抗体已经用酶(enzyme)标记了，即可用来直接测定抗原的量，若无，则可利用另一个酶标记的二级抗体来测定抗原的量。测定抗原量的方法是加入该酶的底质(substrate)，作用后产生出现的颜色深浅和样本中的抗原量呈正比的关系，依此原理计算出样本中的抗原总量或浓度。
 

　　1.直接法(direct ELISA)将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。

　　2.间接法(indirect ELISA)此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：交互反应发生的机率较高。

　　3.双抗体夹心法(sandwich ELISA)被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量;或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

　　4.竞争法(competitive ELISA)样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体，当样品里的自由抗原越多，就可以结合越多的抗体，而固定抗原就只能结合到较少的抗体，反之亦然。经清洗步骤，洗去自由抗原和抗体的复合物，只留下固定抗原和抗体的复合物，拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较，根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。优势：可适用比较不纯的样本，而且数据再现性很高。缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

　　5.ELISA技术基于细胞法(cell-based ELISA)：是一种新的定性蛋白检测技术，将细胞直接在微孔板里培养，待检测时，不需抽提蛋白和裂解细胞，便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化。

　　优势：无需裂解细胞，所以目标蛋白损失最少，可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞。

　　缺点：不能测定抗原量。ELISA实验中可能影响结果的原因及解决方法样品收集和保存用于ELISA测定最常用的临床标本是血清(浆)。要注意避免严重溶血，因为血红蛋白中含有具有类似过氧化物活性的血红素基团，在孵育时很容易吸附于固相，与HRP底物反应产生假阳性。样品采集及血清分离中要注意避免细菌污染，一方面细菌分泌的酶可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用;

　　另一方面，细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶会对相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。样品应该要避免反复冻融。因反复冻融所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。另外，样品混匀时，不要剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。一般而言，如果在收集样品的当天进行检测，可将样品及时储存在4℃备用;而对隔天再检测的样本，应及时分装后冻存在-20℃备用，若要长期保存样品，最好将其置于-70℃冻存。

　　注：本产品不能用于临床。

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