实验知识分享：ELISA步骤、试剂及注意事项

　　实验知识分享：ELISA步骤、试剂及注意事项
 

　　操作步骤

　　方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

　　1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10μg/ ml。在每个聚苯乙x板的反应孔中加 0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲 液洗 3 次，每次 3 分钟。(简称洗涤，下同)。

　　2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 小 时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

　　3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育 0.5～1 小时，洗涤。

　　4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37℃10～30分钟。

　　5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。

　　6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测 O·D 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后 测各孔 O·D 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。
 

 

　　方法二 用于检测未知抗体的间接法：

　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1～10μg/ml，每孔加 0.1ml，4℃过夜。次日洗涤 3 次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小时, 洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育 30-60 分钟，洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。

　　试剂器材品

　　1. 试剂

　　(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59 克 NaHCO3 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml

　　(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO4·12H2O 2.9 克NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml

　　(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血 清等 血清与洗涤液配成 5～10%使用。

　　(4) 终止液(2M H2SO4)：蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

　　(5) 底物缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克/L) 25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2 克/L) 24.3ml 加蒸馏水 50ml。

　　(6)TMB(四甲基lb胺)使用液:TMB(10mg/5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75%H2O2 32μl

　　(7) ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3%H2O2 2μl

　　(8)抗原、抗体和酶标记抗体。

　　(9) 正常人血清和阳性对照血清。

　　2. 器材:

　　(1) 聚苯乙x塑料板(简称酶标板)40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50μl 及 100μl 加样 器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

　　(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

　　(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

　　注意事项：

　　1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份， 以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。

　　2. 在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

　　(1) 固相载体的选择：

　　许多物质可作为固相载体，如聚氯乙x、聚苯乙x、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙x凹孔板。 不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观 察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

　　(2) 包被抗体(或抗原)的选择：

　　将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好, 吸附时一般要求 PH 在 9.0～9.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采 用 4℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10μg/ml 等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1～10μg/ml。

　　(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：

　　首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记 抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗 体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

　　(4) 酶的底物及供氢体的选择：

　　对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反 应，而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使 用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。

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