人胰岛素原(PI)ELISA试剂盒实验原理

　　人胰岛素原(PI)ELISA试剂盒实验说明书

　　BS-0657人胰岛素原(PI)ELISA试剂盒

　　一、实验原理

　　本试剂盒采用双抗体夹心法检测人胰岛素原(PI)水平。将纯化的人胰岛素原抗体包被于微孔板形成固相抗体，加入待测样本后，样本中的胰岛素原与固相抗体结合，再加入酶标记的胰岛素原抗体形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经彻底洗涤后加入底物TMB显色，TMB在HRP酶催化下转化为蓝色，酸性条件下最终变为黄色。颜色深浅与样本中胰岛素原浓度呈正相关，通过酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，根据标准曲线计算样本浓度‌。

　　二、试剂盒组成

　　包被抗体预包被微孔板

　　酶标记抗体(浓缩液)

　　标准品(不同浓度)

　　通用稀释液

　　20×洗涤液浓缩液

　　TMB底物溶液

　　终止液(酸性溶液)

　　封板膜

　　说明书

　　三、样本要求

　　样本类型

　　血清‌：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟(2000-3000转/分)，收集上清。如有沉淀需再次离心‌。

　　血浆‌：使用EDTA或柠檬酸钠抗凝，混合10-20分钟后离心20分钟。避免使用溶血或高血脂样本‌。

　　细胞培养上清‌：离心20分钟收集上清。检测细胞内成分时需用PBS稀释细胞悬液至100万/ml浓度，反复冻融释放成分‌。

　　尿液、胸腹水、脑脊液‌：无菌管收集，离心20分钟，取上清‌。

　　样本处理

　　样本收集后若不及时检测，建议分装冻存于-20℃(保存12个月)或4℃(保存6个月)，避免反复冻融‌。

　　样本检测前建议用通用稀释液稀释1倍以减少基质效应，结果计算时需乘以稀释倍数。

　　四、实验步骤

　　1. 试剂准备

　　酶结合物工作液‌：实验前15分钟将100×浓缩酶结合物离心1分钟，用通用稀释液稀释为1×工作浓度(如10μL浓缩液+990μL稀释液)，当日使用。

　　1×洗涤液‌：取10mL 20×洗涤液浓缩液加入190mL蒸馏水，室温轻摇至结晶完全溶解。

　　2. 操作流程

　　平衡‌：从4℃取出板条，室温平衡10分钟，剩余板条密封放回4℃。

　　加样‌：每孔加入100μL标准品或样本(空白孔加100μL通用稀释液)，37℃温育1小时。

　　加生物素化抗体‌：弃去液体，每孔加入100μL生物素化抗体工作液，37℃温育1小时。

　　洗板‌：每孔加入300μL 1×洗涤液，静置1分钟后甩干，重复洗涤3次。

　　加酶结合物‌：每孔加入100μL酶结合物工作液，37℃温育30分钟。

　　再次洗板‌：重复步骤4洗涤5次。

　　显色‌：每孔加入90μL TMB底物，37℃避光温育15分钟。

　　终止‌：每孔加入50μL终止液，立即在450nm波长测定OD值。

　　五、结果计算

　　计算标准品和样本复孔的平均OD值，减去空白孔OD值得校正值。

　　以浓度为横坐标、校正OD值为纵坐标，绘制四参数逻辑函数标准曲线。

　　根据样本OD值在标准曲线上查得浓度，若样本OD值高于曲线上限，需稀释后重测并乘以稀释倍数。

　　六、注意事项

　　试剂保存‌：未使用试剂盒保存于4℃(6个月)或-20℃(12个月)，避免反复冻融‌。

　　样本处理‌：避免使用溶血、高血脂或浑浊样本，离心后需确保上清澄清‌。

　　操作规范‌：加样时避免气泡，洗涤需彻底;显色后需及时终止反应。

　　质量控制‌：建议设立复孔以提高准确性，标准曲线需每次实验重新绘制。

　　应用范围‌：本试剂盒仅供科研使用，不适用于临床诊断或治疗‌。

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