大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　BS-3172大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)ELISA试剂盒

　　一、实验原理

　　本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)。将纯化的大鼠Ⅳ型胶原(ColⅣ)抗体包被于微孔板，形成固相抗体。样本中的ColⅣ与固相抗体结合后，加入生物素标记的检测抗体，形成"抗体-抗原-酶标抗体"复合物。经彻底洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素(Streptavidin)，与生物素结合形成免疫复合物。加入底物TMB显色，TMB在HRP催化下转化为蓝色，并在酸作用下变为黄色。颜色的深浅与ColⅣ浓度成正比，通过酶标仪在450nm波长测定吸光度(OD值)，计算样品浓度‌。

　　二、试剂盒组成

　　预包被抗体的96孔酶标板(Coated Wells)

　　标准品(冻干粉，需配制)

　　酶标抗体工作液(HRP标记)

　　20×浓缩洗涤液(Wash Buffer)

　　底物A液(TMB，避光保存)

　　底物B液(避光保存)

　　终止液(Stop Solution，含硫酸，避免接触皮肤)

　　样本稀释液(Sample Buffer)

　　三、实验准备

　　1. 试剂平衡

　　所有试剂使用前需在室温(18-25℃)平衡20-30分钟。

　　浓缩洗涤液用蒸馏水按1:20稀释(如50ml浓缩液+950ml蒸馏水)‌。

　　2. 标准品配制

　　标准品冻干粉加1ml蒸馏水溶解，配成2000ng/ml母液。

　　梯度稀释(示例)：

　　2000ng/ml(原液)

　　1000ng/ml(1:1稀释)

　　500ng/ml(1:2稀释)

　　250ng/ml(1:2稀释)

　　125ng/ml(1:2稀释)

　　62.5ng/ml(1:2稀释)

　　31.25ng/ml(1:2稀释)

　　0ng/ml(空白对照)

　　3. 样本处理

　　血清‌：室温静置10-20分钟，2000-3000rpm离心20分钟，取上清。避免溶血，-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

　　血浆‌：EDTA抗凝，采集后30分钟内离心，处理方法同血清‌。

　　组织/细胞上清‌：离心后取上清，必要时用样本稀释液稀释。

　　四、操作步骤

　　加样‌：

　　设空白孔、标准孔、样本孔(建议复孔)。

　　标准孔：每孔加50μl标准品。

　　样本孔：先加40μl样本稀释液，再加10μl样本(稀释5倍)。

　　使用一次性无酶吸头，避免交叉污染。

　　温育‌：

　　37℃恒温箱孵育30分钟。

　　弃去孔内液体，拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，重复3次‌。

　　加酶标抗体‌：

　　每孔加50μl酶标抗体工作液。

　　37℃孵育30分钟，洗涤3次。

　　显色‌：

　　每孔加底物A液50μl，B液50μl，37℃避光孵育15分钟。

　　终止反应‌：

　　每孔加终止液50μl，终止液接触皮肤需立即冲洗。

　　测定‌：

　　450nm波长测OD值，15分钟内完成。

　　五、注意事项

　　试剂安全‌：

　　避免终止液和底物接触皮肤，操作时戴手套。

　　实验室内禁止饮食、吸烟，使用化妆品。

　　操作规范‌：

　　使用一次性吸头，避免金属部分接触试剂。

　　洗涤液用塑料容器配制，充分混匀试剂。

　　洗涤时拍干酶标板，勿用吸水纸直接吸水。

　　试剂保存‌：

　　未使用板条密封保存，避免受潮‌。

　　不同批号试剂勿混用，过期试剂勿用。

　　样本要求‌：

　　避免使用含NaN3的样本，因NaN3抑制HRP活性。

　　样本稀释液仅用于稀释样本，勿用于其他试剂。

　　六、结果计算

　　以标准品浓度为横坐标(X)，OD值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

　　样本OD值代入标准曲线方程，计算浓度，乘以稀释倍数得实际浓度。

　　七、性能指标

　　灵敏度‌：最小检测浓度通常低于10ng/ml。

　　特异性‌：不与大鼠其他胶原类型交叉反应。

　　重复性‌：板内、板间变异系数均<10%。

　　八、有效期与保存

　　试剂盒2-8℃保存，有效期6个月‌。

　　平衡后的试剂室温保存，避免长时间暴露。

　　注：供科研使用，以上资料供参考，不作为实验依据，具体请咨询技术老师是或品牌商。

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