酶联免疫实验：ELISA常见类型介绍

　　酶联免疫实验：ELISA常见类型介绍
 

　　酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测，使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似，可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物(如肽、蛋白、抗体和小分子)。抗体对分析物产生特异性，并且一部分(如辣根过氧化物酶 [HRP])直接或间接偶联抗体，从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份，可以让终端用户调整适当的检测，以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

　　即使ELISA从原理上来说都是一样的，但是仍然可以细分成一些不同的类型：

　　直接 ELISA

　　在直接 ELISA 中，抗原直接结合微孔板表面，随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之，实验步骤的第一步便是将抗原固定在微孔板上。第二步是添加一种封闭试剂，防止检测抗体出现非特异性结合。接下来，添加直接偶联某种酶(如 HRP)的检测抗体。该检测抗体将结合抗原，并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限，可让实验设置整体简化。

　　直接法优缺点：

　　优点：1：快速，仅使用一种抗体且步骤较少;2：消除了第二抗体的交叉反应性。

　　缺点：1：一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响;2：为每个特定的ELISA系统标记一抗，既费时又昂贵;3：由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度;4：抗原的固定化不是特异性的，有较高背景干扰。

　　

 

　　间接 ELISA

　　间接 ELISA 类似于直接 ELISA;但主要的差别在于会通过第二偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的第一步便是将抗原固定在微孔板上。第二步是添加一种封闭试剂，防止结合抗体出现非特异性结合。第三，添加一种抗原特异性结合抗体，短暂孵育后，用缓冲液洗涤板孔，以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测，其中添加一种抗体来检测第一结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。第二抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的第二抗体来进行多个实验，前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是第二抗体会放大信号，因为大约 2 个抗体将结合第一抗体。随着步骤数量的增加，实验步骤通常会耗时更长，并且更容易出错。此外，背景信号可能会增强，因为所需的试剂数量更多，每一种都可能会出现非特异性结合。

　　间接法优缺点：

　　优点：1：可以在一个物种中制备许多一抗，并且可以将相同的标记二抗用于检测;2：由于没有标记，保留了第一抗体的最大免疫反应性;3：高标记的二抗密度可实现高灵敏度，从而导致信号放大。

　　缺点：1：二抗可能会发生交叉反应，从而导致非特异性信号;2：这个过程中需要一个额外的孵育步骤

　　

 

　　夹心法 ELISA

　　在夹心 ELISA 中，抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中，第一抗体被吸收进入微孔板孔中，在洗涤和封闭后，添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的第二抗体。这种第二抗体通常偶联某种酶，因此它可用来检测。洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂反应孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

　　夹心法优缺点：

　　优点：1：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的;2：适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测;3：灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

　　缺点：1：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位：2：价格较贵，时间消耗多。

　　

 

　　竞争性ELISA

　　竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA，它对干扰预计信号的程度进行定量，以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶，并用于检测。如果实验含有次于最大量的检测靶标，则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合，从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

　　竞争法优缺点：

　　优点：1：灵敏度高以及灵活性高;2：能测定微量的分析物。

　　缺点：1：特异性较低;2：需要酶标记的抗原。

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